新希望：干细胞有望治疗“冠状病毒”引起的重症肺炎
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撰文｜东海先生
编辑｜南风
声明｜本文仅作为公益科普，拒绝商业用途的转载，亦不构成任何建议。
导语 / Introduction
现代医学发展至今，除了少数几种病毒能被研究者成功开发疫苗，面对绝大部分病毒感染依然是束手无策。面对2019-nCoV新型冠状病毒引起的重症肺炎，间充质干细胞（MSC）能否帮上忙，协同治疗重症肺炎？
临床研究已经发现了MSC成为治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）免疫异常、乙型肝炎病毒（HBV）慢性肝炎、流感病毒急性肺损伤（ALI）等病毒相关疾病的有效工具。MSC能否协同治疗2019-nCoV新型冠状病毒引起的重症肺炎？这个问题需要从多个维度来讨论和论证。
冠状病毒引起的重症肺炎
首先，如果冠状病毒引起的轻度肺炎，是不需要干预治疗的，人体具有一定的自愈能力。需要治疗的是冠状病毒引起的重症肺炎。
临床上不同人类冠状病毒的致病特点：
表 1. 人冠状病毒及其受体、发病率和感染数据
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来源：参考资料[1]
严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)通过高细胞分裂素血症和侵袭性炎症的机制，出现了病毒快速复制、大量炎性细胞浸润和促炎细胞因子/趋化因子反应升高，导致致命的急性肺损伤(ALI) [1, 2]。SARS冠状病毒引起肺损伤和炎症的部分原因是通过肾素血管紧张素途径的作用[3]。SARS冠状病毒通过人血管紧张素转换酶2（HACE2）感染人气道上皮细胞（HAE）细胞，hACE2是SARS冠状病毒进入HAE纤毛细胞的主要受体[4]。最终死于SARS的患者表现出肺促炎堆积，而出现了促进伤口愈合的巨噬细胞的缺失[2]。
表2. 冠状病毒致病机制
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来源：参考资料[1]
人类和动物的研究都表明，在人类冠状病毒感染后，炎性单核细胞-巨噬细胞和中性粒细胞在肺部积聚。这些细胞是人类冠状病毒致死性疾病相关的细胞因子和趋化因子的主要来源[5, 6]。病毒的快速复制和旺盛的促炎细胞因子/趋化因子反应的最早后果之一是肺上皮细胞和内皮细胞凋亡；上皮细胞和内皮细胞的凋亡破坏了肺微血管和肺泡上皮细胞屏障，导致血管渗漏和肺泡水肿，最终导致缺氧[7-9]。
肺部巨噬细胞的功能和表型可能会随着其极化状态的不同而变化，这取决于细胞因子环境[10, 11]。病毒损伤肺细胞，吸引了巨噬细胞的聚集，巨噬细胞试图消除炎症。但是，病毒的快速复制和大量破坏肺细胞，过激的炎症环境反而诱导M1型极化，从而加剧了肺部炎症。
图1. 流感病毒引起肺病的病理学
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来源：参考资料[1]
在正常情况下，凋亡细胞会被常驻吞噬细胞悄悄清除，而不会引起炎症。相反，急性组织损伤通常伴随着炎症，即使在非免疫性或非感染性损伤的情况下也是如此[12, 13]。坏死细胞释放的细胞成分和微血管损伤导致血管通透性增强，巨噬细胞和中性粒细胞浸润。SARS患者肺泡巨噬细胞(AM)和CD8+T细胞增多；而SARS恢复期部分患者肺炎消退延迟，可能与冠状病毒清除延迟有关[14]。重要的是，坏死细胞的吞噬作用会导致促炎因子的释放，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、各种趋化因子和白三烯，以及自由基[17]。
包括B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞在内的获得性免疫细胞也与组织损伤和修复密切相关[15，16]。冠状病毒特异性T细胞对于病毒清除和限制对宿主的进一步损害至关重要[19]。此外，T细胞反应也会抑制过度活跃的先天免疫反应[20, 21]。致病性人类CoV引起的旺盛的炎症反应减弱了T细胞的反应，在SARS-CoV感染的情况下，通过TNF介导的T细胞凋亡，从而导致失控的炎症反应[1]。
MSC能否被病毒感染？
（1），疱疹病毒
疱疹病毒包括巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒-1（HSV-1）和单纯疱疹病毒-2（HSV-2）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）和水痘带状疱疹病毒（VZV），是免疫受损宿主的主要病原体[22]。人巨细胞病毒通过改变骨髓MSC的细胞表面分子库，从而改变了骨髓MSC与造血干细胞之间的相互作用模式；巨细胞病毒还损害MSC的成脂和成骨分化过程[23]。最近的一项研究表明，CMV感染通过减少IDO的表达，严重损害了MSC介导的免疫抑制功能[24]。来自骨髓的MSC对CMV感染很敏感，在19例人CMV血清阳性的健康成人中分离的7例骨髓的MSC中检测到低拷贝数的人CMV-DNA[25]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）可以感染人类胎儿MSC，但不能使这些细胞永生和转化[26]。
胎儿膜源性间充质干细胞（FM-MSC）可以被HSV-1、HSV-2和VZV感染，但不会感染EBV和人类疱疹病毒6、7和8（HHV-6、HHV-7和HHV-8）感染；这些病毒能够进入FM-MSC，但是由于病毒基因表达受限，并没有发生生产性感染[27]。
在从18名骨关节炎（OA）患者和10名健康人中分离和培养骨髓MSC；18名OA患者骨髓MSC中总病毒DNA检出率为16.7%（3/18），其中有1人B19（病毒载量，61.2拷贝/微克DNA）阳性，2人VZV（平均病毒载量，14.4拷贝/微克DNA）阳性，没有人感染HHV-6；健康人骨髓MSC的总病毒DNA检出率为20%（2/10），在患者和对照组之间没有统计学上的显著差异[28]。这也说明人群中普遍存在各种病毒的感染（携带者）。
（2），细小病毒
20例健康供者骨髓MSC中有1例含有细小病毒B19的DNA。骨髓MSC表达B19受体（P抗原/球蛋白）和辅受体（Ku-80），并能在体外将B19传递给骨髓细胞，提示病毒可以在健康人的骨髓基质中持续存在[29]。不过，两名接受造血干细胞移植的患者接受了B19阳性的MSC作为移植物抗宿主病的治疗，既没有出现病毒血症，也没有出现症状的B19感染[29]。
（3），HIV
HIV-1的发病特点是CD4+T细胞逐渐耗尽，最终导致临床上的免疫缺陷。在HIV感染的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗的非免疫反应者(NIRS)中，MSC被认为能够通过降低CD8+T细胞的激活来改善宿主免疫重建的结果，这可能导致更有效的CD4+T细胞恢复[30, 31]。HIV蛋白TAT和Nef可以通过增强炎症或减少自噬来诱导MSC衰老，从而减少可用的成骨祖细胞的数量[32]。这也解释了与非HIV感染者相比，HIV感染者的骨密度较低，骨量减少/骨质疏松的患病率较高的现象。
HIV-1感染可以抑制骨髓MSC的克隆形成能力，增加促炎细胞因子（TNF-𝛼、IL-1𝛽、IL-6和MIP-1𝛼）的水平[33]。用HIV-1患者的血清培养MSC，明显促进MSC的成脂分化[34]。然而，不能排除血清样本中存在的HIV-1蛋白酶抑制剂（PI）对MSC向脂肪分化过程的抑制作用，因为PI治疗与脂质代谢紊乱有关[34]。从HIV-1转基因小鼠分离培养的MSC的增殖、分化和细胞因子的产生明显受损；与健康的MSC相比，移植TG26 HIV-1转基因小鼠的MSC对急性肾损伤小鼠的改善效果较差[35]。
HIV-1感染还参与了血管壁来源的MSC的分化紊乱。HIV-1能够将其基因组整合到血管壁周围MSC的DNA中，这表明MSC可能是潜在的感染库[36]。
（4），乙肝病毒（HBV）
乙型肝炎是最常见的传染病之一。全世界约有3.6亿慢性HBV感染者，每年有60万人死于与HBV相关的肝病或肝细胞癌。初步研究结果显示，人MSC能够改善患有终末期肝病的乙型肝炎患者的肝功能[37, 38]。然而，输注的MSC是否对HBV感染敏感，这种细胞类型是否起到肝外病毒库的作用？从健康捐赠者获得的MSC完全支持HBV的感染、复制、表达和分泌，这可能使MSC成为病毒的储存库[39, 40]。但是，从乙型肝炎患者的骨髓中分离出MSC，发现骨髓MSC在体外诱导分化的肝细胞对HBV感染都有抵抗力[41]。而且脂肪MSC同样在体外对HBV感染不敏感[42]。我国学者证明乙肝病毒感染母亲分娩的小孩脐带MSC中并未检测出乙肝病毒[43]。
（5），禽流感病毒
流感病毒（AIV）在禽类中引起疾病，包括鸡、鸭和火鸡。有几种AIV亚型，如H5N1、H7N9和H9N2，可以跨越物种障碍，感染哺乳动物[44, 45]。禽流感在人类中的症状从典型的人类流感样症状（例如发烧、咳嗽、喉咙痛和肌肉疼痛）到肺炎、严重的呼吸系统疾病（如急性呼吸窘迫和急性肺损伤）、失控的全身炎症反应和其他严重威胁生命的并发症[46, 47]。然而，禽流感的症状可能取决于引起感染的是哪种病毒[45]。虽然抗病毒药物可以减轻症状的严重程度和持续时间，但它不能消除流感症状，也不能修复病毒相关炎症造成的组织损伤。
然而，MSC已被证明对禽流感病毒感染敏感。高致病性禽流感A（H5N1）病毒(HPAI H5N1)能够感染人原代MSC，病毒感染导致MSC凋亡和免疫调节活性丧失[48]。同样，原代鸡MSC可以复制H1N1和H9N5禽流感病毒株，从而导致MSC细胞裂解，以及细胞因子和趋化因子的产生[49]。然而，目前没有证据表明流感病毒直接感染体内注射的MSC。此外，病毒和MSC的相互矛盾的观察可能是由于不同的病毒株和实验设计所致。
已有研究表明，抗炎治疗可以减轻病毒诱导的小鼠肺损伤和死亡率[50]。鉴于MSC具有免疫调节和再生特性，以及分泌内皮和上皮生长因子的能力，MSC治疗通过降低趋化因子和促炎细胞因子水平，减少炎症细胞向肺内募集，大大改善了由禽流感H9N2病毒引起的小鼠急性肺损伤[51]。也有研究显示以预防或治疗方式给予MSC并不能减轻急性严重流感的结果[52, 53]。
MSC消除炎症的机理
MSC具有低免疫原性以及显著和广泛的免疫调节功能[54]。MSC不表达CD40、CD80和CD86等共刺激分子以及MHC-II类分子[54-56]。人MSC在体外不刺激异体或异种淋巴细胞的增殖[56, 57]，注入动物体内也不会激活明显的免疫反应[58, 59]。还值得指出的是，MSC对T细胞的抑制作用不受MHC的限制，即对自体和异体的T细胞的作用相似[60, 61]。除T细胞外，MSC对B细胞的增殖、分化和抗体产生也有抑制作用[62, 63]。还有一些研究发现，MSC对NK细胞增殖、细胞因子分泌以及细胞毒性作用也有明显抑制作用[64-67]。
MSC抑制免疫细胞的研究结果显示出不同的刺激机制和抑制机制[68-72]。
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来源：参考资料[1]
目前的多数观点认为，MSC分泌的可溶性因子对其免疫调节作用具有重要作用，而MSC与免疫细胞之间的接触虽然可以增强其抑制作用但并非必需[55, 63, 73, 74]。研究表明转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、前列腺素E2（PGE2）、IL-10、sHLA-G5等可溶性因子参与MSC的免疫调节作用[64, 73-78]。
单核巨噬细胞是天然免疫和获得性免疫反应协调和表达的重要元素，这些细胞在炎症和宿主防御中发挥中心作用[79, 80]。炎症消退是一个主动的、有组织的过程，其中巨噬细胞是炎症消退的重要贡献者[81, 82]。巨噬细胞的一个基本功能是吞噬凋亡的中性粒细胞碎片，并受cAMP控制[83]。在吞噬降解过程中，巨噬细胞产生“抗炎”细胞因子（如IL-10和IL-1RA），它们是M2极化的一部分[84]。MSC条件培养液可以增加巨噬细胞数量，MSC释放的因子将巨噬细胞招募到创面，从而促进创面愈合[85]。Toll样受体-3激活的MSC显著延长中性粒细胞的存活和功能，有利于增强中性粒细胞的抗感染作用[86]。
MSC在病毒感染后对T细胞应答中的差异性作用
众所周知，MSC在体外可以抑制同种异体抗原诱导的T细胞增殖活化。然而，MSC对感染性病原体免疫应答的免疫抑制作用仍存在争议。抗病毒反应对于根除病毒和防止病毒相关疾病的发展至关重要。如果允许抗病毒特异性T细胞在MSC存在的情况下发挥作用，它们就有能力保持宿主防御感染的完整性。
有研究发现MSC对抗病毒T细胞反应的抑制作用不大，与MSC共同培养的EB病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)或巨细胞病毒CTL在体外保持了增殖和产生干扰素-𝛾的能力，并对病毒感染的细胞具有杀伤作用[87]。MSC来源的干扰素-𝛾被认为通过介导病毒感染过程中的部分细胞毒性反应来抵消MSC的免疫抑制效应[88]。
需要注意的是，体外实验发现在MSC存在的环境下，免疫细胞对病毒的杀伤作用有所减弱，比如脐带MSC在体外抑制Vγ9Vδ2-T细胞对H1N1流感病毒的细胞毒作用[89]。有临床报告显示，两名接受MSC治疗急性移植物抗宿主病（GVHD）的患者具有持续的巨细胞病毒特异性T细胞，并保留了对巨细胞病毒感染的干扰素-𝛾应答[87]。其他临床研究也表明，MSC治疗不会增加病毒重新激活的风险，也不会损害宿主免疫反应，与对照组相比，接受MSC治疗的儿童没有更多的病毒感染[90, 91]。一篇文章报道了在体外和临床研究之间相互矛盾的结果：在体外，MSC对人类腺病毒（HAdV）特异性T细胞的激活没有影响，而在接受MSC治疗的儿童中，HAdV感染与存活率降低有关[92]。因此，在将MSC作为再生医学使用时，认识到MSC对免疫系统抗病毒感染的双重作用是非常重要的。
MSC具有协同抗病毒效应
随机对照临床试验，通过统计学分析，发现MSC治疗组和对照组的感染率没有差异，明确提出MSC治疗不会增加感染的风险[93-95]，而且MSC治疗组和对照组在恶液质和成瘤方面没有差异[93-96]。长期观察也没有发现病人增加微生物感染和MSC致瘤的现象[91, 97]。这些临床循证医学的证据说明MSC进入人体后，对免疫系统的免疫功能并不是全面的抑制作用。
有趣的是，MSC能够产生和分泌大量的抗菌肽，人抗菌肽Hcap-18/LL-37，它参与了体外和体内的细菌清除[98]。动物模型实验证明MSC在网状感染模型中促进大肠杆菌的清除和保持生物假体完整性[99]。此外，在炎症细胞因子的刺激下，色氨酸代谢酶IDO阳性的人MSC对一系列临床相关的细菌、原虫寄生虫和病毒显示出广谱的抗菌作用[100]。涉及抗菌活性的不同因素，以及临床前和临床研究都需要进一步研究，以解决MSC确切的抗菌效应功能。
在干扰素-𝛾存在的情况下，巨噬细胞病毒和单纯疱疹病毒1型复制的减少是由IDO的表达介导的；向系统中添加IDO抑制剂可以消除这种作用，表明IDO介导的色氨酸分解代谢与MSC的抗病毒效应功能密切相关[100]。目前的数据，均不能证明MSC具有直接的抗病毒活性结论。在一项脐带MSC治疗耐药性难治性HIV感染患者的临床研究中，脐带MSC增加循环中幼稚的和中枢记忆的CD4 T细胞计数，并恢复免疫不应答患者（INR）中HIV-1特异性IFN-g和IL-2的产生，有效促进INR宿主免疫重建，逆转HIV-1感染导致的INR免疫缺陷[31]。乙肝终末期肝病患者输注MSC，配合常规抗病毒治疗和其他对症处理，能降低乙肝患者的感染率，从而提高终末期肝病患者的生存率[101]。
因此，虽然MSC存在被病毒感染的可能性，虽然MSC没有直接的抗病毒作用，但是输入健康的MSC能通过重塑患者的免疫系统，提高抗病毒药物的治疗作用。
MSC在肺部滞留反而适合治疗肺部疾病
外周静脉输入MSC后，大部分的MSC滞留在肺部[102-108]，然后随着血流达到肝脏、肾脏、脾脏[109]。虽然全肺均有MSC分布[102]，有研究显示右肺聚集MSC的数量多于左肺[109]，也有研究显示MSC在左肺聚集多于右肺[110]。
MSC注射1小时后，50-60%的MSC滞留在肺部[104, 105]，3个小时后降至30%，并维持到96小时[104]。有肺损伤同时存在时，MSC在肺部的滞留增多[111]，甚至可高达83%[106]。虽然外周静脉输入的MSC大部分在肺部滞留并被清除，但是MSC可以被肺部局部的微环境所激活，分泌大量的抗炎因子TSG-6，有利于减轻炎症和减少心梗缺血区的面积[106]。MSC分泌的TSG-6减弱了由局部组织巨噬细胞启动的炎性级联反应[112]。
治疗时机
炎症环境可能不利于MSC发挥治疗作用。在病理状态下，缺血缺氧微环境有利于MSC分泌更多的生长因子，而且炎症因子（TNF-α和IL-1β）能促进MSC分泌细胞因子（IL-1A、RANTES、G-CSF），但是总体来讲，炎症环境对MSC的影响是弊大于利。因为炎症因子同样能导致MSC死亡，炎症环境还能提高MSC的HLA-DR（MHC II类抗原）抗原的表达，增强了MSC的免疫原性，被免疫细胞所识别，加速了MSC的清除。
急性肝功能衰竭的猪实验发现，严重的炎症环境限制了MSC的效果，因为MSC在严重炎症的肝脏环境中存活率低[113]。MSC未能提高伴有全身性炎症的慢加急性肝功能衰竭患者的存活率，但是减轻炎症明显有利于提高MSC的治疗效果[114]。在一项MSC治疗儿童激素难治性GVHD的多中心临床研究中，MSC在疾病早期介入治疗比晚期治疗更有效[115]。MSC也被应用于肾脏器官移植的临床研究中，发现在移植前给与MSC输入治疗，有利于减少器官移植后出现的排异反应，促进器官移植的成活率和恢复器官的功能[116, 117]。当然，在肝脏移植后出现免疫排异反应，MSC也是可以发挥免疫抑制作用[118]。这些数据清楚地表明，严重的炎症环境可能会减弱MSC的治疗效果。输注的MSC最终被宿主T细胞、NK细胞和巨噬细胞清除或杀死。因此，需要多次输注MSC，以确保预期的显着治疗效果。
总结
由于MSC和病毒感染的临床经验在很大程度上仍不清楚，未来更多关于MSC在感染环境中的行为的研究将更好地解释这一故事。目前唯一明确的是，MSC细胞本身的安全性很好，但是MSC制剂的安全性和生产制备工艺密切相关。
另外，如果MSC可能有某种病毒的靶点，那么给这种病毒感染的患者注射MSC可能会影响临床疗效，因为这种病毒会感染输入的MSC，进而影响MSC的治疗功能。因此，需要高灵敏度的检测方法来筛查供者和受者MSC中各种病毒的存在，以降低任何病毒相关性疾病的发生率，并确保基于MSC的治疗的安全性和有效性。
综上所述，MSC具有抑制免疫反应、消除炎症，促进巨噬细胞的吞噬清除抗炎功能，潜在地保护肺支气管上皮细胞和内皮细胞避免凋亡和稳定肺微血管和肺泡上皮细胞屏障等功能，MSC有望成为“冠状病毒”诱发重症肺炎的重要治疗手段。
参考文献
[1] 新希望：干细胞有望治疗“冠状病毒”引起的重症肺炎
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